細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是用來檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、侵襲性、對(duì)殺傷因素敏感性等項(xiàng)目的重要技術(shù)方法。
一、實(shí)驗(yàn)原理
接種細(xì)胞后,只有同時(shí)具有貼壁和增殖活力的細(xì)胞才會(huì)形成克隆??寺⌒纬陕史从臣?xì)胞的獨(dú)立生存能力的強(qiáng)弱,用于評(píng)價(jià)細(xì)胞群體依賴性和增殖能力??寺⌒纬陕逝c接種密度有一定關(guān)系,在進(jìn)行測(cè)定時(shí)需要將接種的單個(gè)細(xì)胞分散為懸液,并直接接種在培養(yǎng)皿中進(jìn)行持續(xù)一周以上的培養(yǎng),并在此期間進(jìn)行檢查。當(dāng)出現(xiàn)新的、由單個(gè)原始生長(zhǎng)出來的完整幾何結(jié)構(gòu)時(shí),則可以停止培養(yǎng)過程。
克隆形成依據(jù)采用的培養(yǎng)介質(zhì)的不同,分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1. 平板克隆實(shí)驗(yàn)(以6孔板為例)
(1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化后,wanquan培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清)重懸成細(xì)胞懸液,并計(jì)數(shù);
(2)細(xì)胞接種:于6孔板培養(yǎng)板中各實(shí)驗(yàn)組接種400-1,000個(gè)細(xì)胞/孔(根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況確定,一般為700個(gè)細(xì)胞/孔);
(3)繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止,中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài);
(4)克隆完成后,在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照,然后PBS洗滌1次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min,PBS洗滌1次;
(5)每孔加入結(jié)晶紫染液1ml,染細(xì)胞10-20 min;
(6)PBS 洗滌細(xì)胞數(shù)次,晾干,數(shù)碼相機(jī)拍照(分別對(duì)整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨(dú)拍照)。
2. 軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)
(1)配制1.2% 和0.7%瓊脂,高壓滅菌后,維持在42℃中使其不會(huì)凝固;
(2)將1.2% 瓊脂與2×培養(yǎng)基混合,鋪入6孔板作為下層膠,每孔1.5ml,37°C孵育30 min使之凝固;
(3)將制備好的單細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻,加入6孔板作為上層膠,每孔1.5ml。待其凝固后,再在上面加入培養(yǎng)基,每3天更換一次;
(4)根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度培養(yǎng)2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小,與平板克隆一樣,每個(gè)克隆>50個(gè)細(xì)胞,顯微鏡拍照。若拍整個(gè)孔,每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色,37°C過夜,拍照。
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